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紫外分光光度法测定峰胶胶囊中总黄酮的含量
【来源:桂西制药】【作者:admin】【发布时间:2010-12-16】
实验部分
1.1 仪器与试药
   TU-1901紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);sartorius  BP2111D 电子天平;水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司);autoscience  AS5150A 超声波清洗器。
   芦丁对照品(0080-9705):中国药品生物制品检定所。其余试剂均为分析纯。
1.2 溶液的制备
1.2.1 对照品溶液的制备
   取经120℃干燥至恒重的芦丁对照品适量,精密称定,加乙醇制成0.2mg/mL的溶液。
1.2.2 供试品溶液得制备
   取本品0.35g精密称定,置50.0mL容量瓶中,加乙醇适量,超声处理(150W,50Hz)45min,取出,放冷,加乙醇至刻度,摇匀,即得。
2 方法与结果
2.1 测定波长的选择
   据药典及文献报道,蜂胶中主要含黄酮类成分,可溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯,故采用甲醇、乙醇、醋酸乙酯、75%乙醇、75%甲醇、60%乙醇作为提取溶剂进行考察。据药典介绍,芦丁最大吸收波长在500nm左右,故取各个样品溶液与芦丁对照品乙醇溶液,以不加样品(但需要加显色剂及NaOH试液)的乙醇溶液为空白,分别于300~600nm波长范围内进行扫描。结果见表1。
表1 不同提取溶剂的提取结果
提取溶剂
甲醇
乙醇
醋酸乙酯
75%乙醇
75%甲醇
60%乙醇
样品吸收波长(nm)
378
402
398
501
378
493
芦丁吸收波长(nm)
503
 
   由表1可见,芦丁对照品在503nm波长处有最大吸收,样品(75%乙醇处理)在501nm波长处有最大吸收,考虑到操作误差及仪器因素,故选择75%乙醇作为样品提取溶剂,501nm作为测定波长。
2.2 标准曲线的制备
   精密量取对照品溶液(浓度0.204mg/mL)1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL,置25.0mL容量瓶重,各加甲醇至6mL,加5%亚硝酸钠溶液1mL,摇匀,放置6min,加10%硝酸铝溶液1mL,摇匀放置6min,加氢氧化钠试液10mL,摇匀,加乙醇至刻度,摇匀,放置15min,按紫外分光光度法(《中国药典》2000年版一部附录VA),在波长501nm处测定吸收度,以吸收度与其对应的浓度计算回归方程。回归方程C=2.4445×10-4+8.495×10-2A;r=0.9999,浓度在0.00816~0.04896mg/mL范围内,与吸收度呈良好线性关系。
2.3  加样回收率试验
   精密称取已知含量的供试品(含量5.74%),精密加入对照品适量(三种不同水平,各两份),按正文总黄酮含量测定方法进行含量测定,计算回收率,其中吸收度已扣除样品空白吸收,结果见表2。
表2  回收率测定结果
NO.
吸收度
样品取样量(g)
样品中总黄酮含量(mg)
对照品加入量(mg)
实测总黄酮含量(mg)
回收率(%)
平均回收率(%)
RSD
(%)
1
0.033
0.0204
1.170
0.816
1.952
95.8
99.0
2.28
2
0.033
0.0202
1.158
0.816
1.952
97.3
3
0.034
0.0171
0.984
1.020
2.005
100.1
4
0.035
0.0178
1.019
1.020
2.059
102.0
5
0.034
0.0139
0.799
1.224
2.005
98.5
6
0.034
0.0135
0.776
1.224
2.005
100.4
2.4 精密度试验
   取同一批蜂胶胶囊样品,按供试品溶液的制备与测定法制备供试品溶液,重复进样测定5次,吸收度(A)的相对标准偏差RSD为1.40%。
2.5 稳定性试验
   供试品溶液于制样后不同时间进样测定,结果见表3。实验所得RSD为1.62%,说明供试品溶液在制样后30min内测定稳定。
表3  供试品溶液的稳定性考察
测定时间(min)
15
20
25
30
RSD(%)
吸收度(A)
0.521
0.517
0.506
0.504
1.62
2.6 样品测定
   取蜂胶胶囊样品6批,按供试品溶液制备,精密量取续虑液5mL至25.0mL的量瓶中,加75%乙醇至10mL,照标准曲线制备项下的方法,自“加5%亚硝酸钠溶液1mL”起,依法操作,另量取乙醇10mL至25.0mL的容量瓶中,照标准曲线制备项下的方法,自“加5%亚硝酸钠溶液1mL”起,依法操作;另精密量取供试品续虑液5mL至25.0mL容量瓶中,加氢氧化钠试液10mL,摇匀,加乙醇至刻度,摇匀,放置15min,作为样品空白,在波长501nm处,以试剂空白液校正基线,测定供试品液与样品空白液吸收度,用供试品液吸收度减去样品空白液吸收度的值代入回归方程计算供试品溶液中总黄酮的量。结果见表4。
表4 蜂胶胶囊含量测定结果
样品编号
测定结果(mg/粒)
平均
1
2
01
24.9
22.0
23.5
02
23.4
21.2
22.3
03
20.6
22.1
21.4
04
20.2
20.1
20.2
05
21.2
21.4
21.3
06
19.9
20.0
20.0
3讨论
3.1 提取方法的考察
取样品5份,按不同方法进行处理,结果见表5。
表5  不同提取方法的提取结果
提取方法
吸光度(A)
总黄酮含量(%)
超声30min
0.343
5.34
超声45 min
0.372
5.76
超声60 min
0.370
5.73
冷浸60 min
0.300
4.66
回流45 min
0.354
5.54
由表5可见,超声45 min,所得的总黄酮含量较其它方法高,故选用超声45 min作为提取方法。
3.2 稳定性考察
    稳定性试验中,每隔5 min测定了样品的吸收度,结果35min时其吸收度降为0.483,RSD为2.93%,且溶液颜色已开始变浅,考虑到对测定结果准确性的影响,故应在显色后30min内测定。
 
 

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